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Quisiera empezar con un recordatorio que a menudo se pierde en las discusiones públicas: Las vacunas de ARNm contra la Covid son productos médicos verdaderamente novedosos.
Antes de las autorizaciones de emergencia de 2020, la tecnología de vacunas de ARNm nunca se había implementado a gran escala en humanos. Solo dos ensayos clínicos, uno de Pfizer-BioNTech y otro de Moderna, habían probado esta plataforma en personas. En total, aproximadamente 37,000 personas habían recibido una vacuna de ARNm en la historia de la medicina (sin incluir la experiencia previa con vacunas contra la rabia, el CMV y el cáncer, limitada a estudios de fase inicial mucho más pequeños). Esto no es una crítica; es simplemente una constatación de hechos. Pero sí significa que el perfil de seguridad a largo plazo de estos productos era, y sigue siendo, incompleto.
Lo que sigue resulta familiar para casi todos los biólogos moleculares. Es complicado, pero intento simplificarlo considerando lo que está en juego. Es importante explicar claramente el marco molecular para todos, ya que la forma en que se elaboran estas vacunas determina directamente el contenido del vial.. Y lo que está dentro del vial, una vez inyectado, viajará por todo el cuerpo y activará una cascada de eventos que pueden tener consecuencias para la salud a largo plazo.
La transcripción in vitro no es solo un detalle de fabricación
Las vacunas de ARNm modificadas se producen mediante un proceso llamado transcripción in vitro (IVT).). IVT es el método utilizado para sintetizar el ARNm modificado que finalmente se convierte en el ingrediente activo de la vacuna.
Esto no es un tecnicismo trivial. La IVT determina fundamentalmente la composición molecular del producto final.
Los científicos de BioNTech, incluidos aquellos que participan directamente en el desarrollo de la vacuna Pfizer, han publicado una revisión detallada1 Se describe cómo las reacciones de IVT generan no solo el ARNm completo deseado, sino también una serie de subproductos e impurezas, cómo se eliminan típicamente y cuáles podrían ser sus consecuencias biológicas si persisten. Moderna también describió en detalle estas instrucciones de fabricación, junto con los subproductos que generan, en sus patentes (US10,653,712 B2 y US10,077,439 B2). Pero lo más importante es que esta biología molecular ya estaba bien establecida mucho antes de la COVID-19. Nada de esto es especulativo.
El material de partida: plantillas de ADN
En esencia, una reacción de IVT comienza con ADN bicatenario que codifica la proteína deseada. En este caso, la proteína de pico del SARS-CoV-2.
La secuencia codificante de la espiga utilizada en las vacunas de ARNm es genéticamente modificada Para mejorar la estabilidad y la tolerancia celular, incluyendo dos sustituciones de aminoácidos que la distinguen de la proteína espiga viral. Esta modificación es intencional.
La plantilla de ADN en sí puede adoptar diferentes formas. Durante los primeros ensayos clínicos de Pfizer, se utilizaron fragmentos de ADN generados por PCR. Sin embargo, el proceso de fabricación comercial dependía del ADN derivado de plásmidos. Esto es importante porque los plásmidos contienen secuencias reguladoras adicionales. En el caso de Pfizer, estas incluyen elementos como el promotor SV40 y las secuencias ori, que plantean dudas si penetran en células humanas.
Una vez que esta plantilla de ADN se agrega a la reacción IVT, junto con la ARN polimerasa y otros componentes, se transcribe en ARNm (Figura 1).
IVT produce subproductos por diseño
Si bien el resultado deseado de la IVT es el ARNm completo, el resultado real es más complejo. Este incluye diversos subproductos en forma de (1) diversas especies de ARN, incluyendo ARN bicatenario (ARNdc), (2) ADN unido al ARN (híbridos ARN-ADN) y (3) el ADN libre del molde original (Figura 2).
La formación de estos subproductos está bien documentada y es inevitable, y es por eso que la purificación posterior es absolutamente esencial para la seguridad.
Figura 2. Subproductos y contaminantes de la fabricación de IVT. Imagen adaptada de 1.
La purificación tiene limitaciones conocidas
Después de la fabricación, hay dos pasos de purificación necesarios para eliminar primero el ADN y luego los subproductos de ARN (Figura 3):
Figura 3. Eliminación de subproductos de IVT. Imagen adaptada de 2.
Para eliminar el ADN, se añade a la mezcla de reacción una enzima llamada DNasa I, comúnmente utilizada para degradar el ADN contaminante. Si bien la DNasa I es eficaz contra el ADN molde libre, múltiples estudios, incluyendo trabajos de los propios científicos de BioNTech, demuestran que la DNasa I es ineficaz para eliminar el ADN unido al ARN (híbridos ARN-ADN).
Esta limitación no es controvertida y está documentada en la literatura.
Lo que han demostrado los análisis independientes
Este contexto es crucial para interpretar análisis independientes recientes de viales de vacunas terminadas.
Investigadores3 y reguladores4 Han reportado la detección de contaminantes de ADN en prácticamente todos los viales analizados. Estos contaminantes incluían ADN bicatenario e híbridos ARN-ADN que parecían resistentes a la digestión con DNasa I.
En algunas muestras, el ADN codificador de picos estaba presente en niveles más de 100 veces superiores a otras secuencias de plásmidos.5, lo que sugiere una digestión desigual o incompleta. La secuenciación y los análisis de PCR cuantitativa detectaron además fragmentos de ADN con una longitud promedio de aproximadamente 200 pares de bases, algunos de los cuales superaban las 4 kilobases. En varios casos, se observaron secuencias que abarcaban casi todo el plásmido.
En conjunto, estos hallazgos plantean serias preguntas sobre la consistencia y la integridad de la purificación durante la fabricación a gran escala, y sobre las posibles consecuencias biológicas de los ácidos nucleicos residuales en las personas.
¿Por qué son importantes biológicamente los contaminantes de los ácidos nucleicos?
El ARN y el ADN son potentes activadores de las vías inmunitarias innatas. Esto no es especulativo. Los receptores de reconocimiento de patrones y la vía cGAS-STING responden con firmeza a los ácidos nucleicos extraños, lo que desencadena inflamación, inhibición del crecimiento e incluso la muerte celular.
Estos mecanismos son precisamente la razón por la que los productos de terapia genética están sujetos a una estricta supervisión de seguridad.
Irónicamente, las vacunas de ARNm contra la COVID-19 se diseñaron con modificaciones específicas para reducir esta potente activación inmunitaria innata. Sin embargo, los híbridos de ARN-ADN y los fragmentos de ADN seguirán provocando fuertes respuestas inmunitarias a pesar de dichas modificaciones.
La persistencia plantea nuevas preguntas
Actualmente existe evidencia sustancial que muestra que el ARNm y la proteína de pico persisten en los tejidos humanos durante semanas, meses e incluso años después de la vacunación (Tabla 1).
Aún no sabemos si esta persistencia refleja una estabilidad prolongada del ARNm, la continuidad de la traducción o mecanismos basados en el ADN. Sin embargo, dada la plausibilidad de la integración del ADN y la longevidad del ADN plasmídico no integrado en las células musculares,6 No es descabellado suponer que la persistencia del ARNm, la proteína y los anticuerpos contra Spike años después de la vacunación no está desvinculada de las impurezas y los subproductos del ADN posteriores a la IVT.
Tabla 1. Persistencia del ARNm y la proteína de la espiga después de la vacunación en humanos
Implicaciones de seguridad a corto y largo plazo
En conjunto, estos datos plantean varias consideraciones importantes en materia de seguridad.
En primer lugar, se han reportado reacciones inmunitarias agudas, incluyendo tormentas de citocinas y anafilaxia, inmediatamente después de la vacunación. Estas fuertes respuestas inflamatorias no deben descartarse de plano como si no estuvieran relacionadas con las impurezas, sobre todo considerando lo que se sabe sobre la activación inmunitaria inducida por ácidos nucleicos.
En segundo lugar, y más crítico, están los riesgos a largo plazo. La expresión persistente de la proteína espiga podría contribuir plausiblemente a síndromes inmunitarios crónicos. Aún más preocupante es la posibilidad de integración del ADN, que conlleva riesgos de mutagénesis insercional o alteración genética. Esto implica un riesgo de cáncer o defectos del desarrollo, dependiendo de dónde y a qué edad se integró el ADN.
Cabe destacar que la propia FDA afirma en sus hojas informativas que estas vacunas no han Se han evaluado su carcinogenicidad (formación de cáncer) o genotoxicidad (daño al ADN), un punto que sería rutinario y esperado en la supervisión de la terapia genética, donde el monitoreo a largo plazo es estándar.
La brecha regulatoria en torno al ADN en las vacunas de ARNm
Dado que ya no existe ninguna disputa sobre la existencia de ADN residual en las vacunas de ARNm, la cuestión es si las directrices actuales y los límites de seguridad son adecuados para las vacunas de ARNm. Nos han asegurado que los subproductos de ADN se encuentran dentro de los límites establecidos en las directrices regulatorias. Entonces, ¿cuál es la guía de la FDA sobre los subproductos de ADN y los contaminantes?
La guía de la FDA más citada sobre ADN residual (≤10 ng por dosis) se desarrolló para vacunas virales producidas en células vivas fragmentadas y "desnudas", con capacidad limitada para penetrar en las células humanas. Sin embargo, las vacunas de ARNm no se producen en células, su ADN residual no deriva de la célula huésped y, lo que es más importante, el ADN en las vacunas de ARNm no está desnudo. Está asociado con los sistemas de administración de LNP, que facilitan especialmente la penetración del ADN en las células. La guía de la FDA de 2010 deja claro que no establece un umbral de seguridad relevante para el ADN asociado con productos basados en LNP.
La otra guía comúnmente citada es la de la OMS para terapias con proteínas recombinantes que abordan el ADN residual en productos como anticuerpos monoclonales u hormonas producidas en células modificadas. En este caso, el ADN residual se origina en células huésped o plásmidos de expresión, se presenta como ADN traza no encapsulado (desnudo), y el producto final es una proteína purificada, no una terapia basada en ácidos nucleicos (vacuna de ARNm). Por lo tanto, esta guía no aplica a las vacunas de ARNm.
Ni la FDA ni las normas regulatorias de la OMS citadas con más frecuencia para el ADN residual fueron desarrollados para vacunas de ARNm y no abordan directamente esta cuestión de seguridad.
Lo que dijo la OMS sobre las vacunas de ARNm después de su implementación
En 2022, la Organización Mundial de la Salud emitió una guía que aborda específicamente las vacunas de ARNm.7Cabe destacar que este documento fue publicado después El lanzamiento global de estos productos. Indica específicamente que esta guía fue en respuesta a:las cuestiones de seguridad, producción y reglamentación asociadas a esta nueva tecnología.El documento también hace varias declaraciones importantes:
"Dado que aún no se dispone de información detallada sobre los métodos utilizados para la producción, los controles aún no están estandarizados para vacunas de ARNm seguras y eficaces y ciertos detalles siguen siendo confidenciales y, por lo tanto, no están disponibles públicamente, no es posible desarrollar directrices o recomendaciones internacionales específicas en este momento."
Además afirma: “Los procedimientos detallados de producción y control…deberán ser discutidos con la NRA [Autoridad Reguladora Nacional] y aprobados por ella.] según cada caso individual."
La OMS reconoce que los controles de las vacunas de ARNm aún no estaban estandarizados y que no era viable establecer directrices o recomendaciones internacionales específicas. Además, se requiere supervisión regulatoria para la evaluación caso por caso por parte de las autoridades nacionales.
Esto se afirmó después de que se implementaron las vacunas de ARNm..
Y al momento de escribir este Substack, la FDA aún no ha establecido pautas estandarizadas para las vacunas de ARNm ni ha proporcionado evidencia y datos basados en la seguridad que respalden los límites del ADN en las vacunas de ARNm.
Finalmente, cabe reiterar: si bien la tecnología de ARNm no es nueva, antes de la COVID-19 se regulaba como terapia génica, no como una vacuna tradicional. Los problemas de seguridad relacionados con los subproductos del ADN en las vacunas contra la COVID-19 serán los mismos que con cualquier vacuna de ARNm, incluidas las de la gripe, el VRS o incluso las vacunas de ARNm contra el cáncer.
Esto se debe a que los productos de ARNm son fundamentalmente diferentes. Deben ingresar a las células y ordenarles que produzcan una proteína extraña. Esto es diferente a cualquier otra vacuna convencional que administra la proteína directamente. No existe precedente clínico para esta plataforma, ni para la administración repetida de dosis. Y, desde luego, tampoco a escala poblacional.
En esta etapa, sin una pandemia, con la acumulación de datos mecanicistas y observaciones clínicas y la proliferación de productos de vacunas de ARNm que llegan al mercado, necesitamos transparencia y un compromiso directo con estudios de seguridad serios por parte de los reguladores, en particular la FDA, que establece pautas críticas para la fabricación de estos productos, especialmente en lo que se refiere a los subproductos del ADN.
La nueva tecnología exige un escrutinio nuevo: no silencio, manipulación ni censura.
Referencias
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S, et al. Mol Pharm. 4 de abril de 2022;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang et al. (2004) – “Detección de la integración del ADN plasmídico en el ADN genómico del huésped tras la inyección intramuscular y la electroporación” (Gene Therapy, 2004). En ratones, se inyectó ADN plasmídico desnudo por vía intramuscular, seguido de electroporación para mejorar la captación. Utilizando una PCR de alta sensibilidad en ADN genómico purificado (con separación en gel para eliminar las formas extracromosómicas), los autores identificaron cuatro eventos de integración independientes a las 4 semanas posteriores a la inyección. La secuenciación de la unión confirmó los sitios de integración aleatorios (sin puntos calientes preferenciales), lo que concuerda con la unión de extremos no homólogos. La frecuencia de integración fue baja, pero medible. Esta es una de las demostraciones más claras de eventos de integración espontánea reales in vivo para el ADN plasmídico desnudo en el músculo. Cabe destacar que este estudio utilizó la administración mejorada de ADN mediante electroporación, que podría compararse con la administración mejorada mediante LNP.
Martin et al. (1999) – “Vacuna de ADN plasmídico contra la malaria: El potencial de integración genómica tras la inyección intramuscular” (Terapia génica humana). Este estudio previo evaluó la MI de ADN plasmídico en ratones y utilizó hibridación Southern blot y PCR en ADN genómico de alto peso molecular para investigar la integración. Si bien la persistencia fue principalmente extracromosómica, informaron evidencia que sugiere una integración poco frecuente en algunas muestras (aunque no con una secuenciación tan definitiva como en trabajos posteriores). Estableció un punto de referencia para un riesgo bajo, pero reconoció el potencial de eventos de muy baja frecuencia, lo que influyó en las directrices posteriores de la FDA sobre vacunas de ADN.
Ledwith et al. (2000) – “Vacunas de ADN plasmídico: Investigación de la integración en el ADN celular del huésped tras la inyección intramuscular en ratones” (Intervirology). El ADN plasmídico desnudo inyectado intramuscularmente en ratones mostró una integración detectable, y aunque no se observó una integración detectable, se detectó ADN en el músculo cuádriceps hasta las 26 semanas. El ADN era extracromosómico.
7 Comité de Expertos de la OMS en Estandarización Biológica, 74.º Informe, Anexo 3. Evaluación de la calidad, seguridad y eficacia de las vacunas de ARN mensajero para la prevención de enfermedades infecciosas: consideraciones regulatorias https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
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La Dra. Charlotte Kuperwasser es profesora distinguida del Departamento de Biología del Desarrollo, Molecular y Química de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tufts y directora del Laboratorio de Convergencia de Tufts. La Dra. Kuperwasser goza de reconocimiento internacional por su experiencia en biología de la glándula mamaria, cáncer de mama y su prevención. Es miembro del Comité Asesor sobre Prácticas de Inmunización.
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